2.1  基因导入诱导多能干细胞  2.1.1  四个基因诱导  2006年，Takahashi等[1]选择24种在小鼠早期胚胎、胚胎干细胞中丰富表达的转录因子，通过筛选、组合，发现Sox2、Oct3/4、Klf4和cMyc 4个因子与胚胎干细胞多能性更为密切相关，并采用反转录病毒载体将它们导入胚胎小鼠或者成年小鼠的不同的纤维母细胞中，获得的新细胞具有和胚胎干细胞类似的多能性，就此命名为诱导多能干细胞。 实验证明诱导多能干细胞功能几乎和胚胎干细胞一样，表达胚胎干细胞的各种表面标记，可以分化为各种组织细胞。但此实验还有很多问题有待解决：①尽管诱导多能干细胞有多能性，但不完全等同于胚胎干细胞。诱导多能干细胞注入囊胚后会产生非正常嵌合体胚胎，这种胚胎植入子宫后无法继续正常发育。②基因表达模式与胚胎干细胞还存在一些不同。③逆转录病毒载体有产生肿瘤的风险。④效率很低。 2.1.2  两个基因诱导  鉴于Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4这4个转录因子表达过程中存在的许多风险性和繁琐性，德国马普分子生物医学研究所的Hans Schöler仅仅利用2个转录因子——Oct4加上Klf4[2] ，就将成年小鼠神经干细胞诱导生成诱导多能干细胞，因为这些神经细胞比胚胎干细胞表达更高水平的内源性Sox2和c-Myc。提示具有适当匹配转录因子的体细胞是生成诱导多能干细胞的一个潜在实用的起始点。 2.1.3  单个基因诱导  Scholer等又将需要的转录因子数目减少为1个——Oct4[3] ，其研究小组将Oct4以反转录病毒为载体插入到小鼠神经干细胞，获得了诱导多能干细胞，并验证了诱导出的细胞具有完全的多能性。虽然重编程的成功率比Scholer用两种因子的时候要低10倍，但是这种只用一种因子的方法与用4种因子进行皮肤细胞，纤维母细胞重编程的效果是一样的。但是单基因诱导诱导多能干细胞的实验中采用的体细胞比较特殊，它已经内源性表达其它两个基因，所以单基因诱导诱导多能干细胞不适用于所有细胞。 2.1.4  载体的不断改进  鉴于反转录病毒载体有产生肿瘤的风险，许多研究者不断尝试新的载体来提高安全性。至今，载体从反转录病毒发展到螺旋核糖核酸肿瘤病毒载体[4] 、腺病毒载体[5] 、质粒载体[6] 、慢病毒载体以及可获得无载体诱导多能干细胞的PiggyBac(PB)转座子[7-8] 。 2.1.5  基因诱导可实现不同种成体细胞直接转化  再编程的出路并不一定要回到胚胎状态，而可以让细胞直接变成另一种新的成熟细胞。Zhou等[9]用小鼠做实验，把3种病毒的混合剂注入成年鼠的胰腺内，感染外分泌细胞，每个病毒携带有一种已知在β细胞发育过程中起作用的基因(Ngn3，Pdx1和Mafa)，通过基因工程操作，把成熟的胰腺细胞再编程为能制造胰岛素的胰岛β细胞。这个研究结果出人意料，因为在生物体内，分化了的细胞几乎从来不改变发展方向。这种细胞的直接再编程对治疗某些疾病来说，也许比采用多能干细胞更简单、更安全。这项技术也许能使科学家们加快在实验室培养所需细胞类型，用确定的因子把培养的一种细胞变成另一种。 2.2  蛋白诱导多能干细胞  传统的基因诱导多能干细胞使用外源性遗传物质，不可避免地对靶细胞自身基因组产生一定的影响，有致癌的可能性。为了避免基因诱导诱导多能干细胞潜在危险，许多研究者做了各种修饰基因的方法。然而各种修饰改善基因的方法仍对细胞的遗传信息产生一些影响，因此基因诱导多能干细胞所存在的根本问题仍未被解决。而蛋白诱导多潜能干细胞的方法是直接向细胞中导入蛋白质，而不是依赖于转录因子，因此不会影响细胞的遗传物质。Zhou等[10]成功地利用蛋白转导域(protein transduction domain (PTD)把在大肠杆菌包涵体内表达、提纯的4个重组蛋白(Oct4， Sox2， Klf4， 和 c-Myc)导入靶细胞内，成功诱导出诱导多能干细胞。诱导的细胞可以稳定的扩大培养30多代，形态特点、功能与小鼠胚胎干细胞无差别，并且可表达典型的多能性标记物。此外，研究者也设计了小鼠体外和体内的实验，证明经过蛋白诱导的细胞具有完全的多能性。 Kim等[11]也开发出来这一新的重组蛋白诱导技术，并抢先一步，将这一技术应用于人体的纤维母细胞上，成功诱导出诱导多能干细胞。 蛋白诱导性干细胞的重要意义包括：①安全性：与基因诱导的诱导多能干细胞不同，部分诱导多能干细胞一旦诱导成功，就不再需要添加4个蛋白，也就消除了致癌的因素，因此部分诱导多能干细胞衍生的细胞治疗手段的癌变风险比基因诱导的诱导多能干细胞显著降低。②普及性：蛋白诱导方法远比基因诱导方法简单易行。这样一来，诱导多能干细胞技术不再被几个资深实验室所垄断，大部分实验室都可以重复蛋白方法而获得诱导多能干细胞。③可行性：由于该方法的简单易行，重复性强，它可以被扩大化、产业化，进而被商业化。蛋白诱导干细胞方法将显著降低利用干细胞对患者“量身定做”的治疗手段的成本，使得这一商业模式成为可能。然而，目前这一技术的效率非常低，有待于进一步完善改进。 2.3  小分子诱导多能干细胞　小分子可直接激活或以某种方式辅助增强体细胞基因组的表达，诱导多能干细胞最理想的方法是找到可以有效再编程细胞，并能产生未被修饰的诱导多能干细胞系的小分子。日前lchida[12]利用高含量的化学荧光筛选方法筛选出了在重编程中可替代Sox2的小分子。该研究组实验发现E-616452和E616451(transforming growth factor-b receptor 1 (Tgfbr1) kinase inhibitors)以及EI-275 (Src-family kinase inhibitor)可通过诱导转录因子Nanog表达，抑制Tgf-β信号来替代Sox2和 c-Myc。并且他们验证了E616451和EI-275发挥该作用依赖于VPA(丙戊酸)，而E-616452则不依赖VPA。目前，他们已经做到用小分子化合物取代部分基因，但是暂时还做不到完全取代基因操作。 小分子诱导表达的可能机制为：①诱导靶细胞本身的再编程转录因子的表达。②诱导其相关的家族成员的表达。③诱导可补充再编程转录因子作用的其他不相关基因的表达。现在，相关研究室正在积极研究以期找到可替代Oct4 、Klf4的小分子，最终彻底用小分子代替基因诱导多能干细胞。 2.4  诱导多能干细胞株间的特性和差异  对来源于17个不同个体的人类胚胎干细胞株进行分析比较发现，这些细胞株间的分化能力有很大区别，神经外胚层、中内胚层组织等容易分化的细胞系谱也显示出显著的株间差异。研究表明分化能力差异的原因，可能与遗传因素不同，各胚胎干细胞株间不同的表观基因组状态有关，但是现在还不明确[13] 。 这种人类胚胎干细胞株间分化能力的差异，在用体细胞核移植法制作的胚胎干细胞或诱导多能干细胞的株间，也同样存在。特别是诱导多能干细胞，和处于未分化状态的胚胎干细胞表达相同的标记基因，因此只能根据向三胚层分化的能力进行定义，目前对于诱导多能干细胞在分子方面的定义，还没有明确、客观的标准。而且，在利用反转录病毒或螺旋核糖核酸肿瘤病毒作为载体诱导的诱导多能干细胞中，多个载体染色体无序地重组入基因组中[14]。即使来源于同一个体的诱导多能干细胞株间遗传背景也不尽相同。对于诱导多能干细胞，如前所述，用各种方法和各种类细胞诱导出的诱导多能干细胞株，其分化能力是否完全一致还尚不明确。最近，由不同组织来源的小鼠诱导多能干细胞分化诱导出的神经细胞在移植时，出现了一定比率的畸胎瘤，根据来源组织不同，细胞株间的安全性也不尽相同[4] 。 Lister 等[15]利用鸟枪法测序技术以单碱基分辨率在诱导多能干细胞和胚胎干细胞的甲基化存在大量相似之处，然而研究的5个诱导多能干细胞系与胚胎干细胞还是有显著地差异，某些差异甚至是在分化后持续存在。而诱导多能干细胞之间的差异则体现在细胞中的甲基化标记上，这些甲基化标记代表了起源的体细胞类型的“记忆”效应以及其他一些诱导多能干细胞特异性改变。 到目前为止，基本还没有报告对大部分诱导多能干细胞株间分化能力进行详细的比较与分析，分化能力与安全性等株间差异，对高效制造用于细胞疗法等移植医疗的细胞和防止移植后出现严重并发症等研究是重要问题，今后，有必要对不同的诱导多能干细胞株进行详细的分析比较。 2.5  提高诱导多能干细胞的转化率  虽然诱导多能干细胞在各方面取得了很快的进展，但诱导多能干细胞技术要真正的用于临床治疗，需要克服的最大问题，就是诱导多能干细胞的转化效率太低。对于提高诱导多能干细胞的转化效率，国际干细胞主流研究方向集中在细胞核内的调控因子和高通量小分子的筛选。日本京都大学研究人员发现，通过降低培养环境的氧浓度，可大幅提高细胞生成的效率，并证明体积分数5%的氧浓度是最合适的[16] 。裴端卿研究员领导的实验团队发现向培养基里添加抗氧化剂可提高体细胞重编程效率，并证明维生素C有这一神奇作用[17] 。研究发现有2种因子——p53 siRNA和UTF1可显著提高诱导多能干细胞的转化效率[18] 。将其与4个诱导基因一起转染到人成纤维细胞中，结果转化诱导多能干细胞的效率可提高100倍。并且值得关注的是，即便剔除c-MYC(具有致癌性基因)同样可以成功诱导诱导多能干细胞。根据山中研究组的报告，令人惊讶的是，导入3因子(Oct4/Sox2/Klf4)后，来源于p53基因缺失小鼠的纤维细胞中，10%都被初期化成诱导多能干细胞，用同一小鼠最终分化成的T细胞制造出诱导多能干细胞成为了可能。同样的，其他研究组用缺失p53的shRNA(small hairpin RNA)的细胞进行实验得出，p53下游的p21和Bax基因表达低下时，诱导多能干细胞的诱导效率上升。另外，其他2个研究组报告，调控p53表达的Ink4/Arf基因表达低下时，初期化效率得到提高。还有其他研究组的结果显示，端粒较短的细胞向诱导多能干细胞转变的初期化过程中，p53起抑制作用。综上所述，包含p53的分子网络对初期化有抑制作用，认为破坏该分子网络可以提高诱导多能干细胞的诱导效率。 2.6  诱导多能干细胞的安全性  诱导多功能干细胞(诱导多能干细胞)能发育成各种组织和脏器，但医学家担心它们发生癌变。日本研究人员报告说，他们用小鼠诱导多能干细胞培育出了癌症干细胞，并确认其发展成癌细胞的过程，这将有助于提高诱导多能干细胞的安全性。日本冈山大学教授妹尾昌治领导的研究小组在美国在线科学刊物《科学公共图书馆综合卷》上报告说，他们首先用小鼠细胞培育出诱导多能干细胞，然后向培养液中添加曾培育过肺癌、皮肤癌等癌细胞的液体，4周后将其中未分化的诱导多能干细胞移植到小鼠皮下。结果，小鼠全部患上了癌症，其部分癌细胞不断分化，还有一些癌细胞向肺转移，研究小组由此确认未分化的上述诱导多能干细胞就是癌症干细胞。研究人员同时发现，在普通培养液中用常规方法培育的诱导多能干细胞，移植后不会癌变，但如果与癌细胞一起培养，多数诱导多能干细胞会死亡。妹尾昌治指出，少数诱导多能干细胞癌变也许是受到癌细胞碎片或者其排出的分泌物影响。研究小组认为，如果能更深入地了解诱导多能干细胞癌变过程及其发展成的癌细胞特点，将有助于预防和治疗癌症。由于癌症干细胞在肿瘤细胞中所占比例只有百分之几，采集非常困难，利用诱导多能干细胞培养成的癌症干细胞可供制药企业开发新药[19] 。 2.7  诱导多能干细胞的应用前景  诱导多能干细胞的出现，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域及再生医学研究领域都引起了强烈的反响，这不仅因为它在基础研究方面的重要性，更因为它能够避免移植物对宿主引起的免疫性疾病，具有广阔的临床应用前景。 2.7.1  具有临床实用前景的诱导多能干细胞的生成及分化  目前，研究者已经诱导出具有临床治疗应用前景的体细胞，如胰腺β细胞[20] 、肌萎缩侧索硬化症的皮肤成纤维细胞[21] 、人皮肤成纤维细胞[22] 、小鼠B淋巴细胞，和小鼠的肝细胞和胃上皮细胞[14,23] 。研究者也尝试了具有临床治疗应用前景的体细胞的分化，如三胚层分化、小鼠心肌细胞和血管内皮细胞[24] 。由于疾病的严重程度和高龄不是影响诱导多能干细胞形成与分化的决定因素，这预示着诱导多能干细胞有良好的临床应用前景。 2.7.2  诱导多能干细胞可提供体外的疾病模型  目前，肌萎缩侧索硬化症和脊髓性肌萎缩患者特异性诱导多能干细胞系[25] ，多种遗传病患者特异性的诱导多能干细胞系，包括帕金森氏病、亨廷顿病、唐氏综合症/21三体综合症 (down syndrome/trisomy 21)等已经建立[26] 。这些患者特异性诱导多能干细胞令体外研究正常和病变的人体组织的形成变得可能，从而有助于探索疾病形成机制以及研发特异性新药。 2.7.3  诱导多能干细胞在动物疾病模型治疗中的应用  Hanna等[27]在小鼠中用诱导多能干细胞治疗了镰刀形红细胞贫血症。Xu等[28]将诱导多能干细胞分化来的内皮前体细胞移植到血友病A小鼠肝脏中，有效地改善了病鼠出血不止的症状。Wernig等[29]将诱导多能干细胞衍生的神经细胞移植入胎鼠脑中，这些细胞可整合进受体鼠的脑中，形成神经胶质细胞和神经元细胞，包括谷氨酸能、GABA能、儿茶酚胺能的各亚型神经元细胞，证明了用诱导多能干细胞进行细胞替代疗法治疗神经系统疾病的可行性。 2.7.4  诱导多能干细胞在遗传育种和品种改良方面的应用  胚胎干细胞作为核供体进行核移植时具有更高的克隆效率，10%-30%的克隆囊胚能够成功发育成新个体，是机体成体细胞的10-20倍。而诱导多能干细胞与胚胎干细胞在各方面都极其类似，并且研究结果也表明小鼠诱导多能干细胞可通过生殖系嵌合遗传到后代，小鼠脑膜细胞来源的诱导多能干细胞注射到小鼠囊胚后可100%产生嵌合体。因此，用诱导多能干细胞取代胚胎干细胞，利用诱导多能干细胞与胚胎聚合和以诱导多能干细胞为核供体进行细胞核移植技术可使一头良种家畜在短期内生产较多的具有遗传同质型的动物，这不但可以充分发挥良种动物的生产潜力，而且可以加速动物良种化进程，达到生产高产优质品种，快速扩繁群体作用。另一方面将诱导多能干细胞诱导技术和细胞核移植技术结合起来还可大量繁殖濒危动物，迅速扩大濒危动物的群体数量，及建立动物诱导多能干细胞库保护稀有动物资源[30] 。 2.7.5  诱导多能干细胞在生产转基因动物方面的应用  通过基因转移技术将外源性基因导入到某种动物基因组上，可改良家畜的某些重要生产性状(如生长率、遗传抗性等)或获得非常规性育种性状(如生产人类药用蛋白、工业用酶等)等。诱导多能干细胞和FS细胞、普通体细胞一样，能够高效的进行外源基因导入、基因敲除和基因改造等遗传修饰操作，通过随机或定向整合将外源DNA插入到基因组中。经过筛选可获得阳性细胞，然后将阳性细胞注入囊胚腔或与其他胚胎聚合可获得嵌合体后代，如果经遗传修饰的诱导多能干细胞分化为生殖干细胞，可获得转基因阳性动物。如果把经遗传修饰的诱导多能干细胞作为核移植供体细胞，利用细胞核移植技术可直接获得转基因动物。因此，将诱导多能干细胞诱导技术和转基因动物技术相结合，可进行定向变异和育种，提高动物的遗传本质，加快动物群体遗传变异程度。并且还可打破物种的界限，克服种间繁殖障碍，突破亲缘关系的限制，获得用传统交配方法无法得到的新性状，除此之外，还可在细胞水平对胚胎进行早期选择，提高选择的准确性，缩短育种时间[30] 。"